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FAQ

マクロジェンジャパンに解析のご依頼をなさるお客様からよくある質問です。

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シーケンス結果を用いて投稿予定ですが必要な情報を教えてください。

•　Sequencing Kit : ABI BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits
•　Sequencer : ABI 3730xl Analyzer (96 capillary type)
•　PCR machine : BioRad DNA Engine Dyad PTC-220
•　Seuencing protocol；
Sequencing reactions were performed in a BioRad DNA Engine Dyad PTC-220 Peltier Thermal Cycler using a ABI BigDye ™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits with AmpliTaq DNA polymerase (FS enzyme) (Applied Biosystems), following the protocols supplied by the manufacturer. Single-pass sequencing was performed on each template using [uiversial or what you selected]primer. The fluorescent-labeled fragments were purified from the unincorporated terminators with an ethanol precipitation protocol. The samples were resuspended in distilled water and subjected to electrophoresis in an ABI 3730xl sequencer (Applied Biosystems).

解析結果グラフにあるPhred Scoreとは何ですか？

Phredとは、
Base callingプログラムであり、シーケンサが作り出したイメージファイル(ABI, SCF, ESDなど)を読み込み、Fasta formatに変換するプログラムです。グラフイメージ中のchromatogramの曲線を見て適切なBaseを指定するとともにスコアまで作りファイルにし、Fourier Transform Algorithmが使用されます。
Phredから得られたスコアをQV (Quality Value)にて塩基配列の正確さを判定することができるようにQVを割り当てております。　QVを単純に「Phred　Score」とも呼ばれます。

QV = -10 * log (P)

Phred　Scoreが20の塩基配列のエラー確率は10-2（正確度99％）
Phred　Scoreが30の塩基配列のエラー確率は10-3（正確度99.9％）
Phred　Scoreが40の塩基配列のエラー確率は10-4（正確度99.99％）

サンプルおよび解析結果の保存期間は？

基本的に、サンプルは到着してから１ヶ月間保存されます。しかし、お客様がご依頼時に「保存しない」を選択した場合には、サービス終了後に即処分します。一方、解析データは、弊社のサーバに１ヶ月間保管するので、その間に必ずお客様のパソコンに保存して使用ください。

プライマーはどのように準備して送ればいいのでしょうか？

お客様がプライマーを用意した場合、サンプル試料とは別の容器（1.5ml チューブ）に5pmol/l (5M)にて基本10lに、ご依頼の反応数ｘ2lを足した分を送ってください。プライマーの濃度が正確でないと「反応失敗」の原因となることもありますので、明確に記入お願いします。

シーケンシング用のプライマーはPAGEおよびHPLC精製以上の品質がお勧めですが、OPC精製においても同様の水準のqualityが保障されるのであれば問題ありません。GC contentは40-60％程度、dimer formationおよびhair-pin formationが4bp以上にならないよう、また、end stabilityが高くないようにデザインしてください。50℃(単一条件下)でannealingするため、Tmは50-58℃をお勧めします。
マクロジェンジャパンから無料で提供されるユニバサルプライマーを選んでいただくときには、必ずシーケンスを確認の上選択いただけるようにお願いします。滅多にないケースですが、いくつかのベクターの場合、ベクターマップに該当シーケンスが存在するにもかかわらずbindingしない場合があります（ex; PET, pCl, pENTR,　pDONRなど）。

DNAはどのように準備した方がいいですか？

Plasmid DNA (high copy number)は100-200ng/l、PCR産物は 50-100 ng/l程度の濃度で、できれば1.5ml チューブに入れて、ご依頼の反応数に応じて必要な量（基本10lに追加１反応につきlずつ増量）を送ってください。試料に、Salt、EDTA、protein、carohydrate、RNA、EtOH、primer dimerなどが残っているとシーケンシング反応の過程あるいはキャピラリの中でinhibitorとして作用する場合もありますので、 purity確保には特に細心な注意が必要です。。

マクロジェンジャパンはDNA Clean upあるいは濃縮サービスは行っておりませんので、お客様が最適な品質を用意して提供することがいい結果につながります。Cosmid、
BAC DNAの場合、もっと多くのDNAが必要になりますので別途お問い合わせお願いします。

追加反応とは？

既に弊社のシーケンスサービスをご利用していり、弊社にDNA(弊社で１ヶ月間保管している間)が残っている場合にご利用できます。例えば、新たなプライマーで解析を行いたい場合に、オーダーシートに必要な事項を記入した上、オーダーシートと一緒に新しいプライマーだけを弊社に送ってくださってもシーケンス解析が可能なシステムです。なお、このサービスは、通常のサービス料金が発生します。

再反応を依頼するには？

解析結果をお客様が検討し、弊社の実験プロセスに問題があると判断されるサンプルの場合、再反応の依頼ができます。もちろん、弊社においてもご依頼のサンプルが弊社「再反応」基準に適しているかどうかをチェックし、再反応を受け付け致します。
再反応の依頼は、弊社「再反応依頼様式」に必要な事項を記入の上、e-mail (customer@macrogen-japan.co.jp)にて申請してください。

再反応とは何ですか？

初回の解析で結果が得られていない場合がありますので、gel runningし、DNAの濃度に合わせ、無料で再び実験を行います。
弊社の再反応基準に合ったサンプルのみ行いますので、適しないサンプルの場合には再反応を受け付けない場合もありますのでご了承ください。なお、サンプルが弊社の再反応基準に適するかどうかは「TroubleShooting」ページで確認できます。

サンプル受付はいつも可能ですか？

基本的に土日祝日は休みですので、平日以外のサンプル受付はできません。
なお、お盆や年末年始の休み期間に関しては「新着情報」を通して改めてお知らせします。

納品(塩基配列結果報告)まで必要な時間は？

一般的に精製DNA状態で塩基配列解析をご依頼なさる場合、マクロジェンジャパンにサンプルが到着してから48時間以内（営業日基準）の納品(塩基配列結果報告)を保障しています。ただし、cellやnon –purified PCR産物およびその他のサービスの場合は追加2-3日ほど必要になる場合もありますので、詳細はカスタマーセンター（customer@macrogen-japan-co.jp）までお問い合わせお願いします。

サンプル送付において宅配便は指定されていますか？

いいえ。お客様が一番楽にご利用できる宅配便をご利用お願いします。

塩基配列解析を依頼したいのですがどうすればいいですか？

初めての方
1. お客様情報を記入の上、弊社（customer@macrogen-japan.co.jp）に送ってください。
2. 弊社が「お客様ID」を発行します。
3. オーダーシートに「お客様ID」など必要な情報を記入し、弊社（order@macrogen-japan.co.jp）に送ってください。
4. オーダーシートと一緒にサンプルを着払いで弊社まで送付してください。

２回目以後の方
1. オーダーシートに「お客様ID」など必要な情報を記入し、弊社（order@macrogen-japan.co.jp）に送ってください。
2. オーダーシートと一緒にサンプルを着払いで弊社まで送付してください。