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マクロジェンジャパンシーケンシングTroubleshootingガイド |
弊社では、初回のシーケンス解析から望ましい結果が得れていないサンプルかつ弊社の「再反応対象」基準をクリアしたサンプルに対し、無料で再反応サービスを行っています。
シーケンシングが失敗することは、大抵サンプルの準備状態や特異的な構造を有することから生じケースが殆どであります。この場合、同一なシーケンシングプロセス上において、あらゆる操作を行っても改善の可能性はないため、弊社における「再反応対象」にはなれません。
ここではお客様各位のシーケンシングデータに対する理解を得るため、頻繁に得られる失敗例を整理しましたので参考にしてください。 |
 マクロジェンジャパンの再反応政策について |
弊社シーケンシングサービスにおいて再反応を行うのは、機械トラブルおよび研究スタップのミスの可能性に対する確認作業の一環として行うものであり、改善の可能性があると判断されるサンプルに限り実施されます。
従って、同じ名前のサンプルであっても再度送っていただくサンプルは「再反応対象」にはなれません。以下に整理しました失敗例については、恐縮ですが全額請求することを原則にしています。 |
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plasmid DNA preparation時、ひとつ以上のコロニーが同時にpickingされた場合および一つのコロニーが二つあるいはそれ以上のplasmidを含む場合において、それぞれ異なるinsertを含んでいることになることから、シーケンシング解析を行うとベクター部分までは綺麗なpeakを示すがinsertが始まる地点からはmulti peakを示す現象です。 |
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| Figure1. Mixed template-plasmid Insert contamination |
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特定の地点以後からmulti peakが表れる傾向はinsert contaminationと類似しているが、insert contaminationの場合、multi
peakの開始地点はinset開始地点と一致していることがcompressionと区分されます。主にcompressionは、secondary
structureにより同一electrophoretic mobilityからそれぞれ異なるサイズのfragmentを形成することになり、特定の地点以後から相互において異なったpeakが同時にdetectionされてmulti
peakを示す現象であります。頻繁ではないがhigh G/C contentあるいは high A/T content regionでこのような現象が起きることもあります。 |
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| Figure2. Compression |
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良好なシグナル強度を持ちながら、相互に異なる位置で異なるpeakが共存する現象をいいます。異なる２つ以上のテンプレートが混ざっているか、一つのテンプレートであるものの偶然２か所以上でhomologyを持つことになるとプライマーがmulti
bindingっすることになるます。 |
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| Figure3. multiple binding |
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long homopolymer region後側にmulti peakが表れる現象です。Polymerizationされる間にhomopolymer regionが正しくpairingすることなく、後側にbase
callingが食い違う状態を示します。 |
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Figure4a. homopolymer region-poly T
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Figure4b.
homopolymer region-poly
A
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Figure4c.
homopolymer region-poly
C
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| Figure4d.
homopolymer region-poly
G |
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正常なシーケンスデータのうち、部分的に1baseがdouble peakを示す状態です。SNAの可能性もあり、確率は低いですがpoint mutationの場合もこのような傾向を見せることもあります。 |
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| Figure5. mixed base |
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major peakがある上、そのpeakと同じであるが少し低いpeakが影のようにbackgroundを形成することをいいます。これは、プライマーが合成される過程で精製が完全でなかったか、あるいはdegradationされた場合に現れる現象です。この場合はプライマーを合成し直す必要があります。 |
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| Figure6.
N-1 primer |
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PCR産物の場合において特定地点からN-1プライマーと同一状態のminor peakを示している現象をいいます。N-1プライマーの場合、プライマーbinding直後からN-1
peakを表せている点が異なります。 |
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| Figure7. frameshift mutation (PCR samples) |
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２個あるいはそれ以上のbaseが続いており、それ以後のシーケンスがmulti peakを示す現象をいいます。これは、repeat構造によってそれ以後のpolymerase
processingが円滑でなくなるか、secondary structureなどの形成に起因していると報告されています。 |
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Figure8a.
repeat-[GCA]
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| Figure8b.
repeat-[TGC] |
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シグナルが急にdown する現象をいいます。通常、secondary structureが形成すれば、それ以上のpolymerizationしないか、著しくシグナルが弱くなります。 |
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Figure9a. abrupt signal loss- stop signal
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Figure9b. abrupt signal loss- drop signal
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| Figure9c. abrupt signal loss- drop signal (GC rich region) |
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Troubleshooting Guide
